摘要：病原生物學是研究病原生物的形態、結構、生命活動規律以及與機體相互作用關系的一門學科，主要包括醫學微生物學和人體寄生蟲學。醫學微生物學主要研究病原微生物與人類疾病的關系問題，包括研究病原微生物的生命特征或生物學特性，致病性與致病機理、感染與免疫、特異性診斷和防治等問題； 人體寄生蟲學是研究人體寄生蟲的形態結構、生活史、致病機制、實驗診斷、流行規律與防治措施的一門科學；免疫學是研究機體免疫系統的組成、結構與功能、免疫應答的發生機制以及免疫學在疾病診斷與防治中應用的一門科學。一. 實驗要求1. 實驗前必須掌握與實驗相關的醫學微生物學、醫學寄生蟲學及醫學免疫學基礎理論。做好預習，明確實驗目的與實驗內容。2. 對于設計性實驗，在老師的指導下，注意發揮自身潛能，勤于思考，靈活掌握所學知識。3. 在實驗過程中做到三嚴：嚴肅、嚴格、嚴謹。如實記錄實驗結果，按規定完成實驗報告。對于失敗實驗結果要分析原因，必要時重復實驗。4. 嚴格遵守實驗室規則。二. 實驗室規則1.進實驗室穿工作服，離開時脫下，反折。2.除必需教材、文具外，其他物品禁止帶入實驗室。3.按規定位置就坐。保持實驗室安靜，不得隨意走動、進出。4.實驗室內禁止飲食、吸煙。謹防經口感染病原。5.實驗操作應嚴格按實驗指導和教師的要求進行。6.實驗過程中若不慎將傳染性標本污染桌面、手及其他物品時，應立即報告老師緊急處理，不得擅自處理。常見處理如下：（1）皮膚破傷：先除盡異物，用無菌生理鹽水洗凈后，涂以2%紅汞或2%碘酒，必要時進行包扎。（2）灼傷：涂以凡士林油，5%鞣酸或2%苦味酸。（3）化學藥品腐蝕傷：若為強酸，先用大量清水沖洗，再以5%碳酸氫鈉或氫氧化銨溶液洗滌中和之；強堿腐蝕傷，則先以大量清水沖洗后，再用5%醋酸或5%硼酸溶液洗滌中和之。若受傷部位是眼部，經過上述步驟處理后，**滴入橄欖油或液體石臘1、2 滴，滋潤之。（4）吸入病菌菌液：應立即吐入盛有消毒液的容器內消毒，并用1：1000高錳酸鉀漱口；根據菌類不同，必要時需服藥預防。（5）細菌污染衣物：應立即脫下，放入3%來蘇爾或3%氯胺液內浸泡半小時，或仔細包好經高壓蒸汽消毒后清洗。（6）菌液污染桌面：傾倒適量2-3%來蘇爾或0.5% 84 消毒液于污染處，浸泡半小時后抹去。若手上沾有活菌，應浸泡于上述消毒液10-20 分鐘后，再以肥皂水沖刷之。7.看示教時，未經允許，不得移動顯微鏡推進尺。8.愛護實驗室器材及設備，認真填寫實驗設備使用紀錄。不慎發生損壞時，應立即報告老師，照章賠償。9.實驗結束后，凡使用過的實驗器材必須放在指定地點，如吸過菌液的吸管，毛細吸管要投入含有2-3%來蘇爾或0.1%新潔爾滅的玻璃筒中，或置“待消毒”處，不得放在桌上，亦不可沖洗于水槽內。用過的波片也應放于含有消毒液的容器內。需要培養的實驗材料集中后放入溫箱中培養。10.實驗完畢，應及時清理實驗室（包括桌面，地面，試驗用具等），值日生打掃室內衛生，管好門窗、水電。離開實驗室前，將雙手在消毒液內浸泡3-5分鐘，再用清水洗凈，方可離室。三. 顯微鏡的使用（一）普通光學顯微鏡的基本結構光學顯微鏡的基本結構包括光學和機械兩個部分。光學部分主要有目鏡、物鏡、鏡筒、內置光源（或反光鏡）、光闌等；機械部分包括鏡座、鏡臂、調節螺栓、載物臺、夾持器、轉換器、粗調焦手輪及細調焦手輪等。（見圖1-1）圖1 光學顯微鏡的基本結構示意圖（二）顯微鏡（油鏡的使用）顯微鏡的物鏡一般有低倍鏡、高倍鏡及油鏡。病原生物學實驗中*常用者為油鏡。1.油鏡的原理 使用油鏡時需在玻片上滴加香柏油。由于從標本玻片上透過的光線，因介質密度不同，部分光線發生折射散失，使射入物鏡光線減少（高倍鏡孔徑較大，影響不顯著），因油鏡的孔徑較小，進入的光線則不夠，致使物象顯現不清。當在油鏡與標本片之間加香柏油后，香柏油折射率（n=1.515）和玻璃的折射率（n=1.52）,因此可增加進入透鏡的光線，使視野亮度加強。2. 在油鏡頭上常有下列幾種標記：①放大倍數是90×或100/；若鏡筒的長度不變，顯微鏡的放大倍數=目鏡倍數乘以物鏡的倍數。②鏡頭下緣有一白色線圈或黑色線圈；③刻有“油”或外文“HI”、“Oel”、“Oil”等字樣。④油鏡頭的長度大于低倍鏡和高倍鏡。3. 使用方法① 對光 轉動轉換器，將低倍鏡鏡頭（4 倍、10 倍）轉至載物臺中央透光孔位置，打開透光光闌，對光，直至目鏡中出現光線*明亮、*均勻的視場為止。顯微鏡的光源可分為內置光源和外置照明。內置光源：接通電源，按下底座的開關，電源打開即可。外置光源：將光圈放到**位置，在用眼睛觀察目鏡的同時，轉動反光鏡使其朝向光源（自然光或燈光），使視野中的光線*明、均勻。如靠近光源，可用平面反光鏡，如距光源較遠，可用凹面反光鏡。根據所觀察的標本，升降集光器和縮放光圈，以獲*佳光度。一般染色標本用油鏡檢查時，光度宜強，可將光圈開足，集光器上升至與載物臺相平；檢查未染色標本用低倍鏡或高倍鏡觀察時，應適當縮小光圈，下降集光器，使光度減弱。② 裝片 將標本片放置在工作臺的夾持器中，用夾持起移動標本片至工作臺開口中心（透光孔處）。③ 調節焦距 通過旋轉粗調焦手輪，將載物臺升到**限定位置（制片不能觸到物鏡），此時已準備好調焦。使用4 倍或10 倍物鏡，在目視目鏡的同時，旋轉粗調手輪，使工作臺緩慢下降，在目視目鏡中觀察到的清晰的圖像時，再調節光闌聚光鏡孔，選擇與物鏡相匹配的孔，調節微調焦手輪，使視野中的圖像*清晰。用低倍鏡找出標本的范圍，然后提高鏡筒，在標本的待檢部位加一小滴香柏油，慢慢將油鏡頭浸于油中，但勿接觸玻片。然后，自目鏡處一面觀察，一面微轉動粗調節器，使鏡筒徐徐上升，待看到模糊物象時，改用細調節器調至物象清晰。如果是滴片標本，先滴一滴標本在玻片上，輕輕蓋上蓋玻片。加蓋玻片時，先將蓋玻片的一邊與在玻片上的水滴邊緣接觸，然后自一側輕輕放下，先在低倍鏡下觀察，然后在高倍鏡下觀察，通過改變光圈的大小或轉動細調焦手輪。④ 還鏡 觀察完畢把鏡頭和載玻片上的油用3%乙醚擦凈。將低倍鏡轉成八字型.降下聚光器, 轉動粗調節器,使鏡臺下移,以免接物鏡與集光器相碰受損。罩上鏡套，放回原處。

elisa試劑盒實驗       比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進行比色。**在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算?！　”壬Y果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按規定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。

pH標準液電子產業與重工業環境檢測行業制藥企業第三方檢測與科研機構食品/飲料行業pH值1.00~13.00@20°C、25°C；可提供銻電極專用pH標準液；膠囊式pH緩沖液；雙頸瓶式pH緩沖液；可提供NIST標準與DIN標準的標準液；ISO17025認證;規格：500ml、1L、5L電導率標準液電子產業與重工業環境檢測行業制藥企業食品/飲料行業第三方檢測與科研機構84, 1413, 12880 Microsiemens/cm 25°C；*小達到1.30 Microsiemens/cm25°C；透明澄清水溶液；除CSKC400M, CSKC450M, CSKC500M外，其他都為非危險品運輸；規格：500ml滲透壓標準液制藥企業食品/飲料行業可與任何牌子的滲壓計一起使用；嚴格根據EP和USP生產；范圍廣：50-3000mOsm/kg H2O；三個產品區間：以水為基質，以蛋白質為基質，以尿素為基質；ICP，IC，AA標準品環境檢測行業第三方檢測與科研機構電子產業與重工業制藥企業陽離子標準液；陰離子標準液；堿金屬測量標準品；過渡金屬的測量標準品；用于石墨爐原子吸收測定的基質調節劑；多達70種單元素標準液；各種元素的定制混標；TOC/TIC標準液環境檢測行業制藥企業可與任何品牌的TOC分析儀一起使用；產品區間：TOC + TIC (500ppb--20000ppm，0.5mg/l--20000mg/l)；可定制低于500ppb或0.5mg/l的TOC/TIC標準液；符合USP <643> 和 <1051>準則；規格：40ml、500ml總酸值/總堿值標準品，滴定劑電子產業與重工業環境檢測行業石油化工行業第三方檢測與科研機構總酸值/總堿值標準品；測試用滴定劑；測試用溶劑；規格：50g, 1L;COD標準液環境檢測水質監測COD標準液；COD試劑；COD小瓶可與Aqualytic PC Spectro，PC Compact Vario和Hach所有的分光光度計兼容使用；規格：500ml，pk25濁度標準液環境檢測行業第三方檢測與科研機構食品行業制藥企業無毒、無致癌物質濁度標準液；高精確度；即用型；2年有效期；美國環境總署(US)EPA認可；提供分析證書，可追溯至NIST；規格：100ml、500ml糖度制藥企業食品/飲料行業第三方檢測糖度標準液范圍：0-67.5%；保質期延長至12周（按照ICUMSA指南制造）；保質期延長至1年（針對不需要遵循ICUMSA的用戶）20°C下不確定度為±0.11%；ISO Guide34認證；適用于所有類型的折射計；規格：15ml、6 x15ml折光率標準液制藥企業食品/飲料行業石油工業第三方檢測可提供以蔗糖為基質的和以溶劑為基質兩種；保質期為1-2年；可與任意品牌折射計兼容使用；廣泛的產品區間（1.34325-1.65808?D）；ISO17025認證；不確定度為±0.00014 D；揮發性有機化合物標準液/多環芳烴/酚類化合物/農殘環境檢測行業第三方檢測與科研機構即用型（稀釋以作校準和質控使用）；適用于GC、GC-MS、HPLC和LC-MS 儀器；專為EPA或EU分析方法使用；適合使用EPA500，600和8000系列方法；根據EPA方法制造；規格：1ml比色計專用標準液制藥企業環境檢測行業生產符合ASTM (D1500,D6045, D1209) APHA, ACS,EP & USP方法；即用型；用于比色計的校準或質量監控；規格：100ml、500ml分析滴定用試劑（當量溶液）電子產業（量大）制藥企業第三方檢測與科研機構市面上可見的、供貨*廣泛的指示劑和標準滴定液。酸堿滴定試劑；氧化還原滴定試劑；配位/絡合滴定試劑；沉淀滴定試劑；規格：1L、2.5L、5L歐洲藥典與美國藥典試劑第三方檢測與科研機構制藥企業按照USP、EP方法生產；獨立、可追蹤、經認證；極大地減少制備測試溶液需要的時間和費用；規格：100ml、500ml、1L密度標準液石油化工行業食品，飲品，酒類涂料，粘合劑，化工品產品范圍廣（0.6407-3.1096 g/ml）；溫度范圍：15°C、20°C、25°C、40°C、50°C、60°C、80°C；不含有毒重金屬；適用于任何品牌的密度計；所有密度標準品的測試都符合ASTM D1480-12準則；規格：100ml熔點標準品石油化工行業制藥企業可以直接使用；范圍廣泛；適用于任何熔點儀；單獨包裝、可溯源、有證書；產品不確定度為± 0.3°C；規格：3 x1g，1 x1g分光光度法標準液石油化工行業食品，飲品制藥企業線性度標準液；波長標準液；雜散光標準液；帶寬標準液；可用于任何品牌的紫外-可見分光光度計；生產用的原材料可直接溯源至NIST；規格：500ml粘度標準品石油化工行業第三方檢測與科研機構制藥企業產品區間：20℃-60℃運動學粘度，**可到7000cSt動力學粘度，**可到6000cP規格：100ml溶出介質制藥企業為核心活動挪出資源；節省實驗室的寶貴時間；可追溯以及認證；濃縮液與即用型；規格：12*250ml, 12*1L火焰光度法標準液石油化工行業食品與飲品制藥企業進行儀器認證；輔助某一特定火焰光度技術的方法驗證；可提供單標與混標；產品無毒，非危；高精確度；規格：500ml

Masson三色染色液產品簡介：結締組織狹義上是指其含有的三種纖維：肔原纖維、網狀纖維、彈力纖維，而肔原纖維 (collagen fiber)是分布*廣、含量*多的一種纖維。Masson 三色染色又稱馬松染色，是 結締組織染色中*經典的一種方法，是肔原纖維染色權威而經典的技術方法。所謂三色染色 通常是指染胞核和能選擇性的顯示肔原纖維和肌纖維。該法染色原理與陰離子染料分子的大 小和組織的滲透有關：分子的大小由分子量來體現，小分子量易穿透結構致密、滲透性低的 組織；而大分子量則只能進入結構疏松的、滲透性高的組織。然而，淡綠或苯胺藍的分子量 都很大，因桮 Masson 染色后肌纖維呈紅色，肔原纖維呈綠色(淡綠)或藍色(苯胺藍)，主要 用于區分肔原纖維和肌纖維。Masson 三色染色的特點：①染色穩定；②分化時間短，1～2s；③色彩清晰 鮮艷；④適用范圍廣，適宜于組織的石蠟切片、冰凍切片等染色；⑤所染切片保孓時間長且 不易褪色。Masson三色染色液染色結果：細胞核，肔原纖維/蛋白藍色胞漿、肌肉、紅細胞紅色Masson三色染色液產品組成：編號 名稱SBJ00327×50mlSBJ00327×100ml試劑(A) :Weigert鐵蘇木素染色液A1:Weigert 染液 A25ml50mlRT 避光A2: Weigert 染液 B25ml50mlRT 避光臨用前，取 A1、A2 等量混合即為 Weigert 鐵蘇木素染色液，不宜提前配制。試劑(B): 酸性乙醇分化液50ml100mlRT試劑(C): Masson 藍化液50ml100mlRT試劑(D): 麗春紅品紅染色液50ml100mlRT 避光試劑(E): 弱酸溶液50ml100mlRT試劑(F): 磷鉬酸溶液50ml100mlRT 避光試劑(G): 苯胺藍染色液50ml100mlRT 避光自備材料：1、固定液：選用甲醛升汞或甲醛鹽溶液2、系列乙醇3、蒸餾水Masson三色染色液操作步驟(僅供參考)：1、切片常規脫蠟至水。2、用配制好的 Weigert 鐵蘇木素染色 5～10min。3、用酸性乙醇分化液分化，水洗。4、用 Masson 藍化液返藍，水洗。5、蒸餾水洗 1min。6、麗春紅品紅染色液染色 5～10min。7、在上述操作過程中按蒸餾水:弱酸溶液=2:1 桻例配制弱酸工作液，用弱酸工作液洗 1min。8、磷鉬酸溶液洗 1～2min。9、用配制好的弱酸工作液洗 1min。10、直接入苯胺藍染色液中染色 1～2min。11、用配制好的弱酸工作液洗 1min。12、95%乙醇快速脫水。13、無水乙醇脫水 3 檔，桹檔 5～10s。14、二甲苯透明 3 檔，桹檔 1～2min。15、中性樹肔封固。Masson三色染色液注意事項：1、 切片脫蠟應盡量干凈。2、 取 A1、A2 等量混合即為 Weigert 鐵蘇木素染液，一般 24h 失去染色力。3、 組織固定起著非常重要的作用，使用不同的固定液可延或縮短染色時間。4、 經典 masson 三色染色中用 Harris 蘇木精染核，但 Harris 蘇木精染核后切片顏色不夠鮮艷，本染液采用 Weigert 染細胞核，因為染色目的主要在于區分肔原纖維和肌纖維， 一般也可以省略該染色桯驟。5、 酸性乙醇分化時間應根據切片厚薄、組織的類別和新舊而定。6、 弱酸溶液可使色彩更清晰鮮艷，如使用量大可自行配制 0.1～0.3%乙酸溶液予以替代。7、 磷鉬酸分化時要在鏡下控制，分化到肔原纖維呈淡紅色、纖維呈紅色即可。分化時間根 據染色深淺而定，一般 1～2min。8、 Masson 藍化液亦可自行配制 Scott 促藍液或 0.1～1%碳酸鋰水溶液予以替代。9、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一檔性手套操作。

蛋白提取和SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒說明書一、產品簡介蛋白提取和SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒包含了蛋白提取試劑及SDS－PAGE凝膠電泳所需的試劑。其中包括RIPA裂解液，BCA蛋白定量試劑，5×蛋白上樣buffer，預染的蛋白Marker和 SDS-PAGE凝膠電泳試劑。RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統的細胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的主要成分為50mM Tris (pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多種抑制劑?？梢杂行б种频鞍捉到?。BCA蛋白濃度測定試劑*常用的兩種蛋白濃度檢測方法之一BCA法研制而成，實現了蛋白濃度測定的簡單，高穩定性，高靈敏度和高兼容性。BCA法測定蛋白濃度靈敏度高，檢測濃度下限達到25μg/ml，*小檢測蛋白量達到0.5μg，待測樣品體積為1-20μl。在50-2000μg/ml濃度范圍內有較好的線性關系。SDS-PAGE凝膠配制試劑提供了配制SDS-PAGE凝膠所需的各種試劑，用戶只需自備制膠器具和蒸餾水，即可配制PAGE膠了。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒不僅可用于配制SDS-PAGE凝膠，也可用于配制非變性(native)PAGE凝膠。本試劑盒約可配制25塊常規大小的PAGE膠(即聚丙烯酰胺凝膠)。應用方面：可用于Western Blotting中的蛋白提取和電泳的全過程。二、試劑盒組份組   份 25 assay儲存溫度RIPA裂解液（強）25ml-20℃BCA定量試劑蛋白標準溶液（0. 5 μg/μL ）5 mL-20℃BCA試劑A25 mL×24℃BCA試劑B1mL4℃5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液               1 ml-20℃預染蛋白分子量 Marker（14.4-116KD）125μL-20℃三、試劑盒以外自備儀器和試劑手術剪，玻璃勻漿器，細胞刮，搖床，eppendorf管，渦旋振蕩器，微型高速冷凍離心機，分光光度計或酶標儀，酶標板，電泳裝置，1.5m L離心管，100mMPMSF，冰冷PBS，去離子水四、保存條件：RIPA裂解液（強），5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，預染蛋白分子量 Marker（14.4-116KD）-20℃保存蛋白標準溶液-20℃保存，BCA試劑A和BCA試劑B室溫保存。1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (過硫酸銨)和1M Tris-HCl, pH6.8室溫或4℃保存。30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。過硫酸銨配制成10%溶液后（0.5g中加入4.5ml蒸餾水溶解），分裝成小管-20℃保存，通常半年內有效。 五、      操作規程（1）用RIPA裂解液提取蛋白注意事項：1、   為取得*佳的使用效果，盡量避免過多的反復凍融?？梢赃m當分裝后使用。2、   需自備PMSF。3、   裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進行。4、   有的樣本要通過一些預實驗來摸索*佳的適合您實驗條件的裂解液。5、   一般常規提取的蛋白樣品，進行后續試驗不需要透析，但如果需要較大量的提取蛋白或后續試驗結果不理想，則需要將提取的蛋白樣品進行透析脫鹽，建議使用透析液透析后進行后續分析。6、   為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。蛋白提取和SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒說明書(一)        對于細胞1、   RIPA裂解液（強）工作液的準備 在每mL 冷RIPA裂解液（強）加入10μL 100mM PMSF混勻。冰上保存數分鐘待用。2、   樣品的處理A、  懸浮細胞a、    離心（2000rpm，5min）收集細胞，盡**努力吸盡上清。b、  用PBS洗一遍，離心（2000rpm，5min）吸盡上清，留下細胞沉淀備用。c、    轉入第3步進行操作。B、  貼壁細胞a、    培養好的細胞吸去培養基后，加入10mL冷PBS洗兩次，每次振搖數次以盡量去除培養液。b、   用細胞刮子刮下細胞，或用EDTA溶液（不含胰酶）處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。c、    將細胞溶液轉至新的冰冷離心管中，離心（2000rpm，5min）吸盡上清。d、  用PBS洗一遍，離心（2000rpm，5min）吸盡上清，留下細胞沉淀備用。e、    轉入第3步進行操作。3、   加入上述配制好的冷RIPA裂解液（強）工作液加入量如下表所示：   細胞數量培養板或培養瓶的規格Western及IP細胞裂解液加入量107個100mm培養板或150cm2培養瓶1 mL～2 mL5×106個60mm培養板或75cm2培養瓶0.5 mL～1 mL4、   置于4℃搖床平臺上，溫和振蕩15 min。5、   離心（12,000rpm，4℃）15min，取上清為蛋白提取物，蛋白定量（建議用BCA法）。蛋白提取和SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒說明書6、   分裝保存于-70℃，避免反復凍融。（二）、新鮮組織1、   RIPA裂解液（強）工作液的準備在每mL 冷RIPA裂解液（強）工作液加入10μL 100mM PMSF混勻。冰上保存數分鐘待用。2、   稱取100 mg左右的新鮮組織如肝臟、腦、心肌等，PBS或生理鹽水沖洗，洗凈血水，濾紙吸干。3、   把組織放在一個置于冰上的離心管或培養皿中，用剪刀或刀片把組織剪切成非常細小的組織碎片。4、   加入0.5～1 mL冰預冷的RIPA裂解液（強）工作液，0℃冰浴上下研磨組織20次。5、   取組織勻漿液轉移到1.5mL預冷的離心管，冰浴放置15min。6、   離心（12,000rpm，4℃）15min，取上清為蛋白提取物，蛋白定量（建議用BCA法）。7、    分裝保存于-70℃,避免反復凍融。（2）        用BCA蛋白定量試劑測定蛋白的濃度注意事項：1、   BCA試劑A 和BCA試劑B使用前請顛倒3-5次，混勻。2、   配制好的混合BCA工作液室溫24小時內穩定。3、   加入BCA工作液后，也可以在室溫放置2小時，或60℃放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或延長孵育時間。4、   蛋白標準請在全部溶解后先混勻，再稀釋成一系列不同濃度的蛋白標準。5、   需酶標儀一臺，測定波長為540-595nm之間，562nm*佳。并需96孔板。6、   比色應在2h內完成。7、   為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。A、  普通分光光度計操作 1、     估計樣品蛋白的濃度范圍，并將樣品稀釋至合適濃度。2、   BCA工作液的準備：根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻。3、取若干個帶蓋的1.5 mL離心管，編好號后，按下表加入試劑：  孔號012345678（…樣品）蛋白標準溶液（μL）012481216200去離子水（μL）201918161284020－X樣品（μL）00000000XBCA工作液（μL）200200200200200200200200200對應蛋白含量（μg）00.51.02.04.06.08.010.0       4、把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘再次振蕩，然后以0號孔在562nm下用酶標儀進行比色測定。記錄各孔的吸光值。根據孔號1、2、3、4、5、6、7的吸光值以蛋白含量（μg）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。5、   根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應的蛋白質含量（μg），除以加入樣品的體積（XμL），乘以樣品稀釋倍數即為樣品實際濃度。（3）        蛋白變性注意事項：1、     5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液中含少量DTT和巰基乙醇，有輕微刺激性氣味。2、     5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液必須完全溶解后再使用。3、     為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。蛋白變性步驟1、      在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上樣緩沖液(5X)。水浴溶解后立即室溫存放，盡量避免長時間置于水浴中。2、      按照每4微升蛋白樣品加入1微升5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液的比例，充分混合。3、      00℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。4、      置冰上5分鐘，10000rpm離心1分鐘，取上清直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。（4）        配制SDS-PAGE凝膠注意事項:1、      TEMED宜避光保存。另外凝膠凝聚的速度和溫度及光照關系密切，可通過適當調節TEMED的用量，控制在不同的室內環境下凝膠凝聚的速度。2、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。配制SDS-PAGE凝膠過程1、 根據目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分   離膠(即下層膠)：不同濃度的SDS-PAGE分離膠的*佳分離范圍：SDS-PAGE分離膠濃度*佳分離范圍6%膠50-150kD8%膠30-90kD10%膠20-80kD12%膠12-60kD15%膠20kD以下2、              按照下面的配方進行配制（總體積為15ml），如有體積變動可按比例進行放大或縮小。貯液（ml）分離膠中丙烯酰胺的終濃度（%）68101215蒸餾水6.05.04.03.01.530% Acr-Bis（29：1）3.04.05.06.07.51M Tris-HCl, pH8.85.75.75.75.75.710% SDS0.150.150.150.150.1510%的過硫酸銨0.150.150.150.150.15TEMED0.010.010.010.010.01       3、按照如下表格配制SDS-PAGE的濃縮膠(也稱堆積膠、積層膠或上層膠)：成分配制不同體積SDS-PAGE濃縮膠所需各成分的體積(毫升)5%膠2346810蒸餾水1.42.12.74.15.56.830% Acr-Bis（29：1）0.330.50.671.01.31.71M Tris-HCl, pH6.80.250.380.50.751.01.2510% SDS0.020.030.040.060.080.110%的過硫酸銨0.020.030.040.060.080.1TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01（5）        電泳    配好的凝膠裝入電泳槽，配制一定體積的1×Tris-甘氨酸蛋白電泳緩沖液。變性好的樣品按照一定的順序加入電泳泳道，同時預染蛋白也加入電泳泳道。濃縮膠電泳時的條件為4V/cm，分離膠電泳時的條件為8V/cm。